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选对凝胶很重要

3种【zhǒng】最【zuì】常见【jiàn】的凝胶包括Tris-Glycine, Bis-Tris and Tris-Acetate. Tris-Glycine凝胶的PH为8.6，且【qiě】保质期很短。在【zài】跑胶的过【guò】程中，PH还有上升的【de】趋势，可达到9.5。这会导【dǎo】致蛋白降解和低分辨率。

Bis-Tris凝胶的PH为【wéi】6.4，相【xiàng】对Tris-Glycine凝胶，稳定性和保质期都有所增加。但这【zhè】种凝【níng】胶需【xū】要【yào】在溶液中增加抗氧化剂，比如DTT，以维【wéi】持蛋【dàn】白【bái】的还原性。

Tris-Acetate 凝【níng】胶的PH为7，跑大分子蛋白会呈现很高【gāo】的分辨率【lǜ】。跑大分【fèn】子【zǐ】蛋白时，我们推荐使用【yòng】Tris-Acetate 凝胶。

凝胶浓度很重要

既然选择了Tris-Acetate 凝胶，还有几个要考虑【lǜ】的问题【tí】。凝胶浓【nóng】度与孔径成反比：浓度【dù】越小，孔径越【yuè】大。较大【dà】的蛋白质更容易【yì】通过较【jiào】大【dà】的孔，所以【yǐ】我【wǒ】建议使用低百分比的凝胶，如7％。可以使【shǐ】用【yòng】梯度凝胶【jiāo】或非【fēi】梯度凝胶，梯度凝胶非【fēi】常适合新样本。

提高转移buffer中的SDS，减少甲醇

转移buffer的组成至关重要【yào】。如【rú】果【guǒ】有【yǒu】甲醇【chún】存在，大分子蛋白【bái】很容易【yì】沉淀。通过减少转移buffer中的甲醇百分比【bǐ】（10％或【huò】更低）来避免这种情况发【fā】生。为了进一步确保蛋白【bái】质【zhì】不会沉淀，考虑添【tiān】加SDS至终浓【nóng】度为0.1％。SDS向蛋白添加【jiā】均匀的负电荷，使得它们【men】更容【róng】易从凝【níng】胶【jiāo】转移到膜【mó】上。

选择合适的膜

膜一般有【yǒu】PVDF膜或NC膜。跑大分子蛋白选【xuǎn】择PVDF膜。如前面【miàn】所说，如【rú】果【guǒ】有甲【jiǎ】醇存【cún】在【zài】，大分子蛋白很【hěn】容易【yì】沉淀。而PVDF膜不需【xū】要在转移buffer中添加甲醇，目的蛋白转印的机会更高【gāo】。两种【zhǒng】类【lèi】型的膜都有各种孔径尺【chǐ】寸，最常见的【de】是【shì】0.2um和0.45um。与凝胶一样，较大的蛋白【bái】比较【jiào】小的更容易穿过大孔【kǒng】隙。大多数蛋白【bái】质【zhì】（> 20kDa）可以用0.45um膜转移，避免使用0.2um孔径。

增加转印时间

在【zài】正确【què】地选择完凝【níng】胶、转印膜及【jí】转移buffer后，转印正式开始。半干转快且方便，但不适用于大分子【zǐ】蛋白。我建议湿【shī】转，因为大分子蛋白转【zhuǎn】移时【shí】间【jiān】很【hěn】慢【màn】，推荐350-400 mA转移90min或 4°C，40 mA，转【zhuǎn】印【yìn】过夜。

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